Coloración Gram de Hucker

Cristal violeta

• Cristal violeta: Solución stock

-Cristal violeta (90-95% contenido del colorante)40 g  -Etanol 95% 400 mL

Disolver y mezclar, Almacenar en un frasco oscuro, Rotular con fecha de un año de expiración y Almacenar a temperatura ambiente.

• Solución de oxalato de amonio (1%)

- Oxalato de amonio (grado reactivo) 16 g  - Agua destilada 1600 mL

Disolver y mezclar en un frasco oscuro, Rotular con fecha de un año de expiración, Almacenar a temperatura ambiente.

• Cristal violeta: Solución de trabajo

-Solución stock de cristal violeta 40 mL  -Solución de oxalato de amonio (1%) 160 mL

Filtrar la solución stock de cristal violeta en una botella de vidrio, Una vez que ha filtrado completamente, filtrar a continuación la solución de oxalato de amonio, Rotular con la fecha de expiración más próxima de cualquiera de las soluciones stock.

 

Lugol de Gram

-Cristal de yodo 1 gr  -Yoduro de potasio 2 gr  -Agua destilada 300 mL

Mezclar los cristales de yodo con el yoduro de potasio en un mortero, Agregar el agua destilada en pequeñas cantidades, Depositarlo en un frasco de vidrio oscuro, Rotular con fecha de 6 meses de expiración, Almacenar a temperatura ambiente.

Precaución: El yodo y yoduro de potasio son corrosivos. Evitar la inhalación, ingestión o contacto con la piel.

 

Decolorante: alcohol – acetona (1:1)

-Etanol 95% 500 mL  -Acetona 500 mL

Mezcla el Etanol con la acetona, Depositarlo en un frasco de vidrio oscuro, Rotular con fecha de un año de expiración, Almacenar a temperatura ambiente.

 

Colorante de contraste: Safranina

-Safranina (certificada) 2,5 gr -Etanol (95%) 100 mL

En un mortero disolver 0,25 g de la safranina (certificada) en 10 mL de etanol (95%), seguidamente agregarle 90 mL de agua destilada.

Almacenar la solución preparada en un frasco oscuro.

 

Decolorante: alcohol – acetona (1:1)

- Etanol 95% 500 mL  -Acetonas 500 mL

Mezclar el Etanol con la acetona, Depositarlo en un frasco de vidrio oscuro, Rotular con fecha de un año de expiración, Almacenar a temperatura ambiente.

 

PROCEDIMIENTO

- Preparar un extendido fino del material en estudio y dejarlo secar al aire.

- Fijar el material al portaobjeto de modo que no sea arrastrado durante el proceso de tinción, pasando rápidamente el portaobjeto 3 ó 4 veces por la llama del mechero o con metanol y dejar secar.

- Colocar el preparado sobre un soporte de tinción y cubrir la superficie con solución de cristal violeta.

- Colorear un minuto y lavar con agua de caño.

- Cubrir la lámina con lugol de Gram durante un minuto. Lavar nuevamente con agua.

- Sostener el portaobjeto entre el pulgar y el índice y bañar la superficie con unas gotas de alcohol acetona hasta no arrastrar más colorante violeta. Generalmente requiere de unos diez segundos o menos.

- Lavar con agua de caño y colocar el portaobjeto sobre el soporte.

- Cubrir la superficie con safranina durante un minuto. Lavar con agua de caño. Dejar secar la lámina.

- Examinar la lámina coloreada al microscopio con objetivo 100 x de inmersión (aceite).

 

Fuente: Manual de Procedimientos Bacteriológicos en Infecciones Intrahospitalarias. MINSA-INS. 2005