Caldo de Nitrato

FUNDAMENTO

El caldo de nitrato es útil en la identificación de microorganismos aerobios y anaerobios facultativos gramnegativos

- La presencia de nitritos en el medio de prueba se detecta al agregar el reactivo A (alfa naftilamina) y B (ácido sulfanílico) en igual proporción, éstos detectan los nitritos con formación de un colorante rojo intenso de diazonio, (para-sulfobencenoazo-alfa naftilamina) después de 1 a 2 minutos, lo cual indica que los nitratos fueron reducidos a nitritos (reacción positiva).

- Si no se observa color después del agregado de los reactivos de prueba, indica que no se han reducido nitratos a nitritos (reacción negativa) o que han sido reducidos a productos diferentes a los nitritos como amoníaco (NH3), nitrógeno molecular (N2) (desnitrificación), óxido nítrico (ON) u óxido nitroso (N2O) e hidroxilamina.

Debido a que los reactivos sólo detectan nitritos, es necesario agregar una pequeña cantidad (aproximadamente 20 mg) de polvo de cinc a todas las reacciones negativas (incoloras) para confirmar que son verdaderamente negativas. Los iones cinc reducen los nitratos a nitritos y el viraje de un color rojo después de 5 a 10 minutos, indica que la reacción es verdaderamente negativa.

- La reducción de nitratos a gas nitrógeno u oxido nitroso se denomina desnitrificación. En el medio caldo, la formación de gas nitrógeno se detecta por la presencia de burbujas de gas en la parte superior del tubo de Durham colocado en forma invertida, lo cual es considerado como una reacción positiva.

 

Nitratos » Nitritos+Reactivos A y B  » Color rojo intenso  (Reducción de

                                                                                             Nitratos a Nitritos)

                                                                                            Reacción Positiva

Nitratos » Nitratos+Reactivos A y B » Caldo incoloro       (No hubo

                                                      (Reacción negativa)   Reducción de

                                                                                         Nitratos) 

                                                   Más Cinc » Color rojo   Reacción

                                                                                        verdaderamente

                                                                                        negativa 

Nitratos » Gas Nitrógeno                 » En tubo de Durham: Reacción

               U otros: (NH3, ON, N2O)       burbujas de gas     positiva 

 

Nota: En el caso de Pseudomonas aeruginosa la interpretación del esquema anterior es diferente ya que convierten los nitratos a nitritos pero que también producen gas de nitrógeno en gran cantidad y por lo tanto la detección de los nitritos después de agregar los reactivos no es observable. Esto se puede comprobar fácilmente al agregar aproximadamente 20 mg de cinc. Cuando los nitratos no han sido convertidos a nitritos, el cinc hace la conversión y el viraje a color rojo intenso se hace presente. Sin embargo, en el caso de las Pseudomonas aerugionsa este viraje no se presenta, lo que comprueba la conversión La producción de gas nitrógeno es detectada por la presencia de burbujas en la parte superior del tubo de Durham.

 

COMPOSICIÓN

Nutrientes: Peptona de carne

Sustrato: Nitrato de potasio

Cloruro de sodio

Reactivos requeridos:

Reactivo A: Alfanaftilamina.

Reactivo B: Ácido Sulfanílico.

Polvo de Cinc.

 

TÉCNICA DE INOCULACIÓN

Rotular el tubo que contiene caldo.

Con un asa recta, tomar un inóculo del agar nutritivo o TSA.

Inclinar el tubo e inocularlo, tocando la superficie interna del tubo, en el ángulo agudo del menisco formado por el caldo.

Incubar a 35°C durante 18 a 24 horas.

Finalizada la incubación, agregar 500mL del reactivo A.

Inmediatamente agregar 500mL del reactivo B.

Leer en los primeros 1 a 2 minutos.

Si no hay viraje de color, agregar una pizca (alrededor de 20 mg) de polvo de cinc.

Observar y anotar si hay presencia de burbujas en el tubo de Dirham.

 

RESULTADOS:

Conversión de nitratos a nitritos positiva: Viraje al color rojo intenso entre 1 a 2 minutos al agregar los reactivos de prueba.

Conversión de nitratos a nitritos negativa: No hay viraje de color al agregar los reactivos de prueba.

Confirmación de la negatividad de nitratos a nitritos: Después de agregar 20 mg polvo de cinc hay viraje de color al rosado durante los primeros 5 a 10 minutos.

Presencia de gas libre de nitrógeno: Presencia de burbujas en el tubo de Durham.

 

Fuente: Manual de Procedimientos de Bacteriología Médica del CNDR/MINSA edición 2004