A.  EXAMEN DIRECTO
MATERIALES
- Materiales para la obtención de muestra.
- Metanol absoluto. 
- Coloración Giemsa diluido 1 en 10 a partir de una solución stock.
- Agua corriente de caño.
- Microscopio con objetivo de 100x.
- Aceite de inmersión. 
MÉTODO
1. Obtener la muestra de frotis o una impronta - frotis. 
2. Fijar las láminas que contienen el frotis o impronta-frotis cubriéndolas con metanol absoluto durante 3 minutos o hasta que se haya evaporado.
3. Cubrir la lámina con coloración Giemsa diluida 1 en 10 a partir de una solución stock por 30 minutos.
4. Descartar el colorante y lavar ligeramente con agua corriente.
5. Dejar secar la lámina a temperatura ambiente durante 10 minutos.
6. Observar la lámina a un aumento 100x, adicionar una gota de aceite de inmersión y examinar el frotis hasta que se visualicen los parásitos. 
LECTURA E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS DE FROTIS
• La observación de formas amastigotes de Leishmania en los frotis indica un resultado positivo.
• El resultado debe informarse: Leishmaniasis (+): observación de amastigotes de Leishmania.
 
B. CULTIVO
CULTIVO DE BIOPSIA (TEJIDO)
MATERIALES
- Materiales para la obtención de la biopsia.
- Papel filtro.
- Una jeringa o micropipeta estéril.
- Placa Petri estéril u homogenizador.
- Vial que contenga solución salina más antibióticos.
- Tubos con medios de cultivo NNN, USMARU o agar sangre.  
MÉTODO
1. Colocar la biopsia obtenida sobre un papel filtro para absorber el exceso de sangre.
2. Enseguida, introducir la biopsia en un vial que contenga solución salina más antibiótico por dos horas, para que el antibiótico actúe sobre la flora  normal de la piel.
3. Triturar la biopsia en un homogenizador o placa Petri estéril que contenga 0,5 ml de solución salina más antibiótico.
4. Con una jeringa o micropipeta tomar la suspensión obtenida.
5. Inocular 0,2 ml de suspensión para cada tubo de medio de cultivo.
6. Mantener los cultivos a una temperatura de 22°C, hasta un máximo de 25°C.
 
CULTIVO DE ASPIRADO (PUNCIÓN - ASPIRACIÓN)
MATERIALES
- Materiales para la obtención del aspirado.
- Solución salina mas antibióticos.
- Tubos con medios de cultivo NNN, USMARU o agar sangre. 
MÉTODO 
1. Obtener la muestra por aspirado (punción - aspiración).
2. Inocular 2 - 3 gotas del material aspirado, en cada tubo que contiene medio de cultivo.   
3. Mantener los tubos de cultivo a 22°C, siendo la temperatura máxima de 25 °C.
 
LECTURA E INTERPRETACION DE RESULTADOS DE CULTIVOS DE BIOPSIAS O ASPIRADO
1. Los tubos deben ser revisados cada 2 días.
2. Utilizando un asa de siembra, tomar una gota del sobrenadante y observar al microscopio de luz con objetivo de 10x en búsqueda de promastigotes.
3. Sólo la observación de formas móviles de promastigotes indica la positividad de la muestra.
4. El resultado debe informarse: Leishmaniasis (+): observación de promastigotes de Leishmania.
 
C. INTRADERMOREACCIÓN DE MONTENEGRO O LEISHMANINA
• La prueba de Montenegro o Leishmanina, es una suspensión de promastigotes (antígeno) de Leishmania, colocados intradérmicamente en la superficie del antebrazo.
• En los sujetos con reacción positiva se produce una reacción de hipersensibilidad cutánea: Se observa generalmente una zona rojiza e indurada en el sitio de la inoculación.
• Un diámetro de induración en el sitio de la inoculación de 5 mm o más se considera positivo. 
MATERIALES
- Una jeringa de 1cc con aguja N° 26 de 1/2 pulgada (jeringa de tuberculina).
- Alcohol al 70%.
- Algodón.
- Leishmanina (antígeno) conservado en refrigeración.
- Un lapicero.
- Una regla graduada en mm. 
MÉTODO 
1. Tomar asépticamente 0,1 ml de leishmanina con la jeringa de tuberculina.
2. Limpiar con alcohol el tercio mediano anterior del brazo izquierdo.
3. Introducir intradérmicamente la aguja de la jeringa con el bisel hacia arriba, cargada con leishmanina. Lentamente introducir el antígeno formando una pequeña pápula.
4. Recomendar al paciente que no debe frotarse en el área de aplicación. 
LECTURA E INTERPRETACIÓN 
1. A las 48 horas leer la prueba.
2. En la zona de la inoculación delimitar el área de induración con el lapicero, de la siguiente manera:
-Trazar líneas con el lapicero desde uno de los bordes de la reacción hacia el centro de la inoculación, avanzando hasta encontrar resistencia al trazado.
- Repetir el trazo de líneas siguiendo los 4 puntos cardinales. 
3. Medir ahora el diámetro vertical (eje Y) del área indurada (pápula) con una regla.
4. Si el diámetro es igual o superior a 5 mm se considera positivo.
 
Fuente: Procedimientos de Laboratorio. Ministerio de Salud. INS. Perú.