Método para muestras contaminadas
• Las muestras contaminadas tales como: esputo, orina, contenido gástrico, etc. deben ser descontaminadas antes del cultivo.
• La descontaminación tiene por objeto:
- Eliminar la flora asociada a M. tuberculosis, cuyos gérmenes se multiplican más rápido que el bacilo.
- Homogenizar (uniformizar) la muestra, especialmente el esputo, a fin de liberar al bacilo M.tuberculosis del mucus, material celular y tejidos.
• Se precede de la siguiente manera:
1. Centrifugar las muestras de orina y contenido gástrico deberán a 3 000 ó 3 500 RPM (revoluciones por minuto) durante 20 a 30 minutos.
2. Eliminar el sobrenadante.
3. Descontaminar y sembrar el sedimento.
DESCONTAMINACIÓN
Descontaminación con centrifugación (Método de Petroff) y uso del medio de Lowenstein - Jensen
1. Trabajar frente a la llama del mechero. Cada operador debe procesar en series de 12 muestras por vez. Es conveniente trabajar utilizando tubos con tapa rosca; si no se cuenta con ellos, usar tubos con tapón de algodón bien ajustado.
2. En un tubo, mezclar 2 ml de la muestra con 4 ml de solución estéril de hidróxido de sodio al 4%. Ajustar firmemente la tapa del tubo, para impedir que al agitarlo se diseminen aerosoles que son peligrosos para el operador.
3. Agitar vigorosamente. Incubar a 37 °C durante 20 minutos, agitando cada 5 minutos.
4. Centrifugar durante 20 minutos a 2 000 - 3 000 RPM y desechar el sobrenadante.
5. Agregar al sedimento 1 - 2 gotas de solución de rojo fenol (indicador de pH) y 1 - 2 gotas de solución de ácido sulfúrico al 10 ó 15% para producir el viraje del indicador, desde rojo violáceo al amarillo anaranjado.
6. Efectuar un lavado para eliminar los restos de ácido sulfúrico: Agregar aproximadamente 3 ml de agua destilada estéril, agitar, centrifugar durante 10 minutos y se desecha el sobrenadante.
7. Inocular el sedimento al medio de cultivo Lowenstein- Jensen. La cantidad inoculada a cada tubo de medio de cultivo es de 4 - 5 gotas. Durante el sembrado de la muestra descontaminada, los tubos con el medio de cultivo deben mantenerse en posición inclinada cerca de la llama.
8. Tomar con una pipeta Pasteur 1 ml de muestra descontaminada y sembrar 4 - 5 gotas en cada tubo de medio de cultivo, dejando escurrir la muestra sobre la superficie del medio, sin tocarla con la pipeta.
9. Una vez sembrados los tubos con medio de cultivo, colocarlos sobre una bandeja de fondo inclinado, para que el líquido sembrado cubra toda la superficie del medio. Llevarlos a la estufa a una temperatura entre 35 y 37°C, dejando floja la tapa de cada tubo para que pueda evaporarse la parte líquida de la siembra.
10. Después de 48 horas, revisar les tubos y, si se ha evaporado el líquido, ajustar la tapa rosca. Si se usan tapón de algodón, flamearlo e introducirlo con una pinza y cerrar con un tapón de jebe estéril.
Descontaminación sin centrifugación y uso del medio Ogawa acidificado
1. Sobre la mesa de trabajo colocar las muestras numeradas y en una gradilla colocar tubos estériles numerados con la misma secuencia de las muestras.
2. Colocar 1 ml de muestra (esputo, sedimento de muestra centrifugada, etc.) en cada tubo estéril de acuerdo con la numeración correspondiente. Agregar 4 ml de solución estéril de hidróxido de sodio (NaOH) al 4%.
3. Dejar a 37°C per 20 minutos en estufa o en baño maría.
4. Retirar los tubos de la estufa o baño maría, homogenizar (mezclar) el contenido de cada tubo con una pipeta e inocular 0,1 ml (por tubo) en dos 2 tubos de medio Ogawa, y bañar toda la superficie del medio.
5. Colocar los tubos en una bandeja de madera de fondo inclinado, e incubar en estufa a 37°C.
Fuente: Procedimientos de Laboratorio. Ministerio de Salud. INS. Perú.
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